合作单位：Shanxi Normal University
参考文献：Qin R, Guo Y, Ren H, et al. Instant adhesion of amyloid-like nanofilms with wet surfaces. ACS Central Science, 2022, 8(6): 705-717. DOI: https://doi.org/ 10.1021/acscentsci.2c00151 (IF=12.7)
背景：
干燥材料可以通过分子间作用力（例如氢键、静电和范德华相互作用）被界面层有效粘附。然而，这种改性对于湿材料表面（如水凝胶和组织）具有挑战性，因为水会分离涂层分子和湿材料表面，并阻止持久粘附所必需的相互作用。这一瓶颈明显限制了水凝胶的开发和应用，因为在水凝胶上接枝功能层将大大扩展它们在许多重要领域的普遍适用性，例如药物递送、生物医学器件/组织工程/可伸缩和生物集成电子产品。虽然目前可以通过在水凝胶框架上进行接枝聚合来修饰水凝胶表面，这种局限界面改性存在几个限制：反应复杂、涂层厚度不可控、生物相容性低以及对表面活性位点的要求（例如，被胺基覆盖的表面）。在这方面，一种具有快速反应速度、低毒性和简单功能化程序的通用和适度的改性湿材料表面的方法仍然是当前材料和化学科学领域的关键需求和核心挑战。
与这种合成困境相反，自然界中的生物已经突破了潮湿表面的水合层，让自己实现了稳定的粘附。例如，藤壶利用淀粉样蛋白系统在固体表面形成稳定的水性粘附。受这一观察结果的启发，在此报道了一种一步、即时（2s内）和无毒的方法，用蛋白质纳米膜修饰湿材料表面，该方法基于在环境条件下在中性水溶液中形成的淀粉样蛋白聚集。在空气/水界面的淀粉样蛋白聚集过程中暴露的疏水性氨基酸残基可以取代水凝胶表面的薄水合层，从而促进蛋白质纳米膜和湿表面之间的快速多重相互作用。基于这一概念进展，本文进一步利用该策略开发用于干眼症（DES）治疗的功能性治疗性隐形眼镜（CL）。选择了人乳铁蛋白（HLF），这是人类免疫系统中的一种防御蛋白，并通过操纵HLF的淀粉样蛋白聚集，将HLF纳米膜粘附到水凝胶CL表面。HLF被美国食品和药物管理局（FDA）普遍认为是一种安全材料，可从人初乳和其他外部分泌物（如眼泪、唾液和精液）中以低成本从市场上获得。然后，这项工作证明，HLF的淀粉样蛋白聚集不仅在各种水凝胶材料上表现出强大的粘附性，而且还包含允许功能分子可控包封/释放的空间。通过这种方式，涂有负载环孢菌素A（CsA）的HLF纳米膜的功能化CL在应用于眼睛时表现出可控的CsA释放，与Restasis相比，CsA的生物利用度提高了至少82%，Restasis是一种商业CsA乳剂，目前是美国FDA批准的唯一DES药物治疗。这一发现将为在湿表面修饰中利用蛋白质淀粉样蛋白家族打开一扇窗。此外，由于DES影响了全球大约三分之一的人口，DES治疗的主要挑战是减慢CsA的释放并提高其在眼部治疗中的生物利用度，将CsA生物利用度提高82%的结果证明了淀粉样蛋白组装在开发用于眼科治疗的智能功能化CL中的巨大潜力。
主要结果：
相变 HLF 纳米薄膜的结构和粘附机制
操纵HLF淀粉样蛋白聚集的方法是一种称为蛋白质相变的方法，其中蛋白质的分子内二硫键被还原以触发从可溶性天然蛋白质相向不溶性蛋白质聚集体的转变（图1A）。在该工作中，将HLF水溶液与三（2-羧乙基）膦（TCEP）溶液混合后，TCEP是一种pH值为5-12的二硫化物还原剂，HLF迅速聚集形成20-25 nm低聚物纳米颗粒，如原子力显微镜（AFM）所反映的那样（图1B）。这些低聚物纳米颗粒进一步进化成两种途径：在空气/水界面处团聚形成漂浮的蛋白质纳米膜，以及在散装溶液中持续生长成微粒（图1A）。HLF浓度越高，蛋白质聚集越快。通常，动态光散射（DLS）反射，在5到60分钟内，系统中观察到尺寸分布从15 nm增加到10 μm。作为人类免疫系统中的防御蛋白，在相变后，对天然HLF的典型革兰氏阳性细菌金黄色葡萄球菌（S.aureus）的杀伤能力得到了高度保留。这表明决定HLF生物学功能的HLF的高碱性N末端区域在相变过程中可能不会受到很大干扰。通过调整空气/水界面的面积，以及长达400 cm的相变HLF（PTHLF）纳米膜，可以很好地调节纳米薄膜的面积很容易在实验室规模获得（图1C）。PTHLF纳米薄膜是无色的，在300至800 nm之间表现出优异的光学透明度（高达∼100%），因此表现为一类独特的隐形涂层，在光学应用中非常有用（图1D）。通过原子力显微镜分析进一步分析，通过简单地控制TCEP溶液的孵育时间和pH值，纳米薄膜的厚度可以很容易地从15到70 nm进行调制，并且纳米薄膜的均方根（RMS）反映了表面粗糙度，仅在1到9 nm之间变化，表明纳米薄膜的表面非常光滑。与以前的研究结果一样，疏水相互作用为促进蛋白质聚集提供了重要的驱动力。在ANS存在下，染色灵敏地检测疏水基团的暴露，HLF和TCEP混合物在475 nm处的相应荧光强度在∼60分钟内迅速增加，并且pH值越高，荧光强度增加得越快，即蛋白质聚集越快。在相变中解锁分子内二硫键后，天然HLF的高能α-螺旋迅速展开并聚集成β片堆叠，硫黄素T（ThT）染色、衰减全反射傅里叶变换红外（ATR-FTIR）光谱和远紫外圆二色谱（CD）结果进一步证实了这一点。这些结果表明PTHLF纳米膜中存在淀粉样蛋白结构。
图1. 漂浮在空气/水界面处的宏观PTHLF纳米薄膜及其形成机制。
淀粉样蛋白结构是自然界表面生物粘附的重要组成部分。尽管淀粉样蛋白介导的粘附在固体表面上的详细机制直到现在还不完全清楚，但官能团通过与表面形成多重相互作用，在很大程度上促进了界面粘附。与干材料相比，淀粉样蛋白在湿水凝胶上的粘附更为复杂，因为在与水凝胶的分子框架相互作用之前，该结构必须首先突破水凝胶表面的水合层。在这方面，PTHLF纳米薄膜可以满足这些要求。PTHLF膜的多个官能团来自淀粉样蛋白聚集体的多功能亲水和疏水氨基酸残基，拉曼光谱的去卷积一致证实了这一点，显示色氨酸（Trp）、酪氨酸（Tyr）、苯丙氨酸（Phe）、半胱氨酸（Cys）和NH的倾向增加2+/NH3+在PTHLF纳米薄膜中。纳米薄膜表面的多功能化学基团支持配位键、氢键以及与材料的静电和疏水相互作用的共同贡献，无论材料表面的化学成分如何。特别是，PTHLF纳米薄膜上明显存在疏水结构，如C1秒脂肪族碳（C-H/C-C）基团的信号在PTHLF纳米薄膜上的所有碳衍生结构中的加权贡献超过43.89%。相比之下，该信号在天然HLF中为26.90%，PTHLF中疏水Trp残基的相应倾向是天然HLF中的1.5倍。这些疏水基团的暴露与蛋白质相变期间发生的疏水性诱导的聚集一致，这促进了蛋白质的疏水侧链对水凝胶表面水分子的消耗。之后，PTHLF纳米薄膜上丰富的官能团可以达到多重分子间相互作用的交互距离（图2A）。
图2.PTHLF纳米膜和水凝胶之间的粘附机制。
分子动力学（MD）模拟在理论上支持了上述推论。S-S键裂解2.8μs后天然HLF的MD模拟表明，未折叠的HLF的结构比天然HLF的结构更松散。由于展开，除脯氨酸（Pro）外，大多数疏水性和亲水性氨基酸残基的溶剂可及表面积（SASA）增加。然后对未折叠的HLF在溶液中25ns进行MD模拟，证明未折叠的HLF会自发移动到空气/水界面。在空气/水界面处，未折叠的蛋白质进一步经历了从无规卷曲到β片的显着构象变化，这与纳米膜中淀粉样蛋白结构的实验结果一致。HLF的SASA降低表明，与溶液中松散的去折叠结构相比，在空气/水界面组装后，未折叠的HLF的结构变得更加紧密，并且亲水残基往往比疏水残基更深地埋在蛋白质分子中。特别是，未折叠的HLF中更多的疏水残基暴露在空气/水界面处，这与XPS和拉曼光谱结果一致，显示PTHLF纳米薄膜上富含疏水残基。空气/水界面处的蛋白质表面呈板状，这为蛋白质与底物的粘附提供了更多的相互作用位点。然后，通过将组装的HLF最初放置在远离聚甲基丙烯酸羟乙酯（PHEMA）水凝胶表面5Å的位置来模拟组装在空气/水界面处的HLF的粘附能力（图2B）。模拟轨迹随后表明，空气/水界面处的蛋白质可以稳定吸附在PHEMA水凝胶上（图2C、D）。随着吸附的进行，接触残基和氢键的数量逐渐增加，而范德华力和静电相互作用在能量上更有利（图2E）。应该注意的是，在开始时，疏水残基的接触数是亲水残基的2.4倍，这证明了疏水相互作用在蛋白质与PHEMA水凝胶相互作用的初始阶段占主导地位（图2E，F）。然后，亲水接触残基的数量增加，而疏水接触残基的数量在20 ps到10 ns之间几乎保持不变。此后，疏水和亲水接触残基的数量基本同步增加；值得注意的是，在最后，亲水接触残留物的数量略高。在接触残基中，疏水残基苯丙氨酸（Phe）、亮氨酸（Leu）、脯氨酸（Pro）和丙氨酸（Ala）倾向于与水凝胶相互作用（图2F）。然而，亲水性接触残基与PHEMA水凝胶的相互作用比疏水接触残基的相互作用在能量上更有利（图2G）。PTHLF残基与水凝胶相互作用的能量分布图（图2H）和某些间隙PTHLF分子和PHEMA相之间的配给表明水凝胶不仅与蛋白质表面的官能团相互作用，还与蛋白质内部的残基相互作用。MD结果表明，PTHLF与水凝胶的粘附过程大致可以分为两步。在初始阶段（0–20 ps），疏水基团促进了蛋白质的疏水侧链对水凝胶表面水分子的消耗。之后，板状PTHLF表面甚至在蛋白质内部的丰富官能团可以达到与水凝胶进行多重分子间相互作用的交互距离。这种来自多功能化学基团的共同贡献导致PTHLF纳米膜与水凝胶具有很强的粘附力。
结论：
在这项研究中，开发了一种淀粉蛋白样纳米膜，该纳米膜可以通过快速淀粉样蛋白聚集立即在水凝胶/组织上形成强粘附（在2s内）。与水凝胶/组织表面的强粘附力归因于PTHLF纳米薄膜表面同时暴露的各种官能团，尤其是大量的疏水基团，有效地突破了水凝胶/组织表面的水化层。PTHLF纳米薄膜没有任何固有颜色，具有出色的光学透明度，可以成为水凝胶/组织表面一类独特的隐形涂层。该涂层在恶劣条件下表现出强大的耐用性，例如水冲刷以及表面活性剂、有机溶剂和极端pH值的存在。纳米薄膜为封装高密度功能分子（如CsA和HA）提供了一个生物相容性平台，具有重要的药用价值。此外，纳米薄膜的孔径分布约为2nm，这允许按需从纳米薄膜中选择性释放活性分子。通过载药纳米薄膜的粘附制备的功能化CL对体内DES治疗表现出优异的治疗效果。与Restasis相比，由功能化CL递送的专门用于DES的CsA的生物利用度至少提高了82%，而Restasis是目前美国FDA批准的唯一药物治疗。减少CsA剂量可以减少或防止眼表刺激和全身副作用（例如，CsA诱导的肾毒性和牙龈过度生长），同时患者对治疗方案的依从性增加。淀粉样蛋白纳米膜的即时粘附对水凝胶/组织表面的修饰为向眼科治疗、生物相容性可穿戴CL电子设备和基于水凝胶的材料/设备输送药物提供了新的机会。
