合作单位：Guangzhou Institute of Energy Conversion
参考文献：Miao Tian, Lingmei Yang, Pengmei Lv, et al. Bioresource Technology, 2022. DOI：10.1016/j.biortech.2022.126769（IF = 9.64）
背景：
生物柴油(脂肪酸甲酯，FAME)是一种新兴的可再生能源，作为化石柴油的替代品，它易于生物降解，无毒，环保。生物柴油由长链脂肪酸的单烷基酯组成，由甘油三酯和短链醇(乙醇和甲醇)的酯交换反应生产。碱、酸和酶(如脂肪酶)是最常用的催化剂。然而，在碱催化的酯交换反应中，碱会与游离脂肪酸反应，产生多余的肥皂和水，这降低了生物柴油的产率，并需要复杂的分离过程。酸催化的酯交换反应需要大量的过量乙醇，高反应温度(大于100℃)，以及能够承受酸催化剂腐蚀的反应器系统。因此，基于脂肪酶的酶催化越来越受到关注，它已成为可持续生产生物柴油的绿色工具。
酶催化生产生物柴油需要大量的甲醇，这会在一定程度上使脂肪酶失活，降低酶的稳定性。因此，提高水溶性脂肪酶的催化活性和甲醇耐受性是提高生物柴油生产效率的重要方法之一。半理性设计方法包括通过定向进化和改变蛋白质特性(如稳定性、立体选择性和底物特异性)的方法来重新设计酶产生新的功能。目前，半理性设计已被应用于修饰脂肪酶的催化性能，用于生产生物柴油。
N-糖基化是一种主要的翻译后蛋白质修饰，蛋白质工程与N -糖基化修饰相结合的半理性设计方法是提高酶催化活性、热稳定性和有机溶剂稳定性的有力工具。研究发现，α-螺旋结构的N -糖基化效率较低，而β-片状结构的N -糖基化效率较高。β-片状也被认为具有一定程度的柔韧性，可能会影响蛋白质的折叠和性能。因此，在脂肪酶β-片状结构中引入N -糖基化修饰，提高其活性和甲醇稳定性，可能是提高生物柴油合成效率的有效途径。米黑根毛霉脂肪酶(RML)是制备生物柴油最常用的生物催化剂之一，在毕氏酵母(P. pastoris)中通常表达为带前肽的RML (ProRML) 。为了提高脂肪酶在生物柴油生产中的催化性能，本文在脂肪酶β-sheet结构中引入N -糖基化修饰的基础上，对 ProRML 进行定向进化，并分析获得的突变体的性质及其在一步甲醇加料法制备生物柴油中的应用。
方案设计：
为确定部分突变体在甲醇溶液中的结构变化，并阐明突变体稳定性提高的原因，经与魔德科技（www.modekeji.cn）技术团队沟通，拟通过分子模拟方法进行研究。
主要结果：
采用从头建模的方法构建了RML的完整结构。一般来说，脂肪酶蛋白可分为“α-β-α”区和“Coil”区。多糖修饰位点Asn9和Asn59位于蛋白的N端区域，而修饰位点Arg267位于蛋白内部的β-sheet上。
为了探索增强甲醇耐受性的机制，本文对非糖基化N9A/N59A和糖基化N267(具有最大的甲醇耐受性)体系进行了MD模拟，并研究了它们在甲醇溶液中的结构变化。
图1
回转半径(Rg)表示体系的疏松程度。N9A/N59A和N267体系的Rg值表明在模拟过程中，体系结构没有出现明显的膨胀或收缩(图1b)。与在水溶剂中的Rg值相比，N9A/N59A和N267体系在甲醇溶剂中的Rg值分别下降了0.16和0.11 nm，这可能是由于甲醇与蛋白质之间的相互作用更强，导致蛋白质结构发生了较大的变化。N9A/N59A和N267体系的SASA（溶剂可及表面积）值在模拟过程中保持稳定，与在水溶剂中的值相比，N9A/N59A和N267体系在甲醇溶剂中的SASA值分别约低23和20 nm2。此外，N9A/N59A体系的SASA在甲醇溶剂中变化较大。在甲醇溶剂中，N9A/N59A和N267体系的收敛参数达到平衡，但体系的结构参数(Rg和SASA)与在水溶剂中相比发生了显著变化。然而，N -聚糖的加入稳定了ProRML的结构，减少了甲醇溶剂对其结构的影响。
为进一步了解N -聚糖的引入对蛋白质结构的影响，对其二级结构进行了分析。N9A/N59A和N267体系的二级结构含量在模拟过程中变化不明显，其中“Coil”结构含量最多，其次是螺旋结构。此外，N267体系的螺旋含量高于N9A/N59A，而“Coil”含量相对较低。由于螺旋结构相对稳定，可以推断N267体系比N9A/N59A体系更稳定。
氢键是分子间结合的主要驱动力。聚糖结构包含许多羟基，可以用作氢键的供体和受体。在N267体系中，N -聚糖与蛋白质之间约有5个氢键，N-聚糖与甲醇溶剂之间约有39个氢键(图1f)。
图2
N -糖基化的作用并不局限于糖基化位点，它可以扩散到蛋白质的其他区域。图2a和2b显示了MD后N9A/N59A和N267体系的构象。在N9A/N59A体系中，Ala9和Ala59氨基酸被周围的氨基酸包裹，并与周围的氨基酸Arg6和Met56形成氢键(图2c)。此外，Ala氨基酸侧链表现出一定的疏水性，与周围氨基酸形成疏水相互作用，进一步稳定其结构。在N267体系中，Asn267上的修饰聚糖与脂肪酶中的许多氨基酸残基形成强氢键，包括Glu84、Glu87、Ser237、Tyr266、Glu291和Tyr293。与非糖基化的N9A/N59A相比，在N267体系中，脂肪酶的N -聚糖和氨基酸可以形成更强的氢键相互作用，可以稳定附近氨基酸的形成。因此，N267的甲醇耐受性强于N9A/N59A。
