背景：
乙酰丙酮是一种用途广泛的商业大宗化学品，广泛用作燃料添加剂、染料中间体、金属萃取、金属电镀和树脂改性等领域。但传统的制备方法存在步骤多、条件恶劣、收率低、环境问题等缺点，阻碍了乙酰丙酮的进一步广泛应用。与传统化学方法相比，生物合成方法具有环境友好、条件温和、选择性高、潜在成本低等优点。若能提高乙酰丙酮分子的生物合成产率，定会大大降低很多商品的原材料成本。
本研究中，受已知乙酰丙酮生物降解途径的启发，首次建立了从可发酵糖合成乙酰丙酮的生物途径，且实验已经证明乙酰丙酮裂解酶（Dke1）催化的乙酰丙酮合成过程是可逆的，经过保守性分析探究和位点突变酶活表征，研究团队在众多位点中发现两个位点——K15Q/A60D突变后可显著提高Dke1酶合成乙酰丙酮的产率，是野生型菌株产率的3.6倍。由于实验条件及时间周期限制，在RCSB数据库中可以获得Dke1酶野生型的晶体结构（PDB ID：3BAL），无法短时间快速获得Dke1酶K15Q/A60D双突变蛋白结构。
方案设计：
鉴于目前无法快速获得Dke1酶K15Q/A60D双突变晶体结构，为了进一步深入研究双突变后Dke1酶蛋白结构如何变化以至于明显提升合成乙酰丙酮的产率，经与四川魔德科技（www.modekeji.cn）技术团队深入沟通，拟基于Dke1酶野生型的晶体结构，采用分子模拟方法获得Dke1酶K15Q/A60D双突的蛋白结构，并研究双突变后底物与Dke1酶蛋白间相互作用变化及蛋白空间构型的改变对催化活性的影响。
主要结果：
- 乙酰丙酮生物合成验证
大量研究报道显示，一个乙酰丙酮分子在乙酰丙酮裂解酶Dke1的催化下降解为一个乙酸酯和一个甲基乙二醛。在本研究中，研究团队受乙酰丙酮生物降解途径的启发，提出了在通过Dke1酶催化，以乙酸酯和甲基乙二醛为底物，合成乙酰丙酮，并设计了一系列实验验证，最终发现在厌氧条件下，Dke1酶可以催化合成乙酰丙酮。进一步通过增加底物浓度，探究Dke1酶活性影响因素，结果表明该酶活性不受底物浓度影响，而是与自身酶活直接相关。因此，为了提高乙酰丙酮的产量，应考虑进一步提高Dke1酶活。
- Dke1酶的合理设计
本研究对Dke1及其同源性较高的27个裂解酶进行了借助定向进化分析，找到了52个保守位点（definitely conserved sites），44个相对保守位点（relatively conserved sites）和19个可变位点（variable sites）。在44个相对保守位点中发现A60、G101、L103、G105和E140五个潜在位点，在19个可变位点中找到了K15、S17和Y21三个非保守位点。随后，进一步对上述8个位点进行单突或双突验证，结果发现K15Q/A60D双突变后，乙酰丙酮的产率增加了3.6倍。
- Dke1酶活性增强机制研究
为了揭示Dke1 (K15Q/A60D)酶活性增加的分子基础，以Dke1的三维结构(PDB ID: 3BAL)为模板，进行突变体结构建模和分子对接，分子对接以催化反应中间体（2,4-Pentanedionyl anion, PDA）进行。通过动力学模拟研究结果表明，Dke1蛋白的K15Q/A60D突变体能够有效提升酶的生物活性，主要体现在蛋白内部通路体积变大。如下图所示，突变前后蛋白的整体结构未发生较明显的变化。但通过对比分析二者进入活性位点的通路发现，在Lys15突变为Gln15之后，附近的通路变大，更加有利于底物的进入，并且由于赖氨酸带正电荷，而催化反应的底物之一是带负电荷的乙酸，因此赖氨酸对乙酸具有较强的吸附作用，导致乙酸较难通过通路进入到活性中心，而突变为中性的谷氨酰胺，对乙酸的吸附作用减弱，因此更有利于底物的进入。
另外，在Ala60突变为Asp60之后，催化活性中心的通路体积有一定程度的增加，这主要是由于在活性位点附近的Ala60属于疏水性氨基酸，其侧链在水溶液中会朝向蛋白内部，而突变为亲水性的天冬氨酸之后，侧链与水溶剂作用较强，朝向蛋白外部，因此可以使活性中心的体系在一定程度上增加，进而更加有利于底物的结合。
综上所述，通过分子模拟研究，从更微观的尺度出发，对比分析发现突变前后，Dke1蛋白内部通路明显变大，这可能更有利于底物的合成，也是突变后Dke1酶催化活性增强的主要原因之一。
看点
实验研究发现的K15Q/A60D双突位点并非Dke1催化反应的直接位点，但却能大幅提高其催化活性，通过动力学模拟在蛋白结构层面的研究发现，双突变后，Dke1酶蛋白活性中心的通道明显大于野生型，进而更加有利于底物的结合，可能是乙酰丙酮产率加倍的主要原因之一。
