2-HF：高强度、超分子水凝胶
合作单位：Sichuan university
参考文献：Wang Z, Zhang Y, Yin Y, et al. High‐Strength and Injectable Supramolecular Hydrogel Self‐Assembled by Monomeric Nucleoside for Tooth‐Extraction Wound Healing[J]. Advanced Materials, 2022, 34(13): 2108300. DOI: https://doi.org/10.1002/adma.202108300 (IF=25.809)
背景：
水凝胶是一种宝贵的软湿材料，由于其结构和组成与天然细胞外基质相似，在生物医学工程领域引起了越来越多的关注。由于其高强度和可注射性，水凝胶被认为是在需要最小或无创治疗的承重组织中实施的理想候选者，例如用于软骨组织工程和骨缺陷的治疗。然而，迄今为止开发的大多数高强度水凝胶由于不可逆的键断裂而遭受永久性损伤，导致剪切减薄注射性差。一般来说，水凝胶的剪切减薄效率与强度成反比。高机械强度通常源于有机溶剂中聚合物链之间强而不可逆的交联相互作用，这限制了它们的剪切减薄敏感性。然而，为了使水凝胶表现出优异的剪切减薄注射性，它必须包含动态共价键或可逆的非共价相互作用，这通常会导致较差的机械强度。因此，开发一种在温和条件下具有高机械强度和优良剪切减薄注射性的水凝胶仍然是一项艰巨的挑战。
虽然氢键是弱的非共价键，但大多数合作的氢键相互作用都具有类似于共价键的强化作用。例如，Tobias等计算出双分子间氢键和单酰胺氢键的结合自由能分别为- 5.5和- 0.34 kcal mol-1，表明双氢键更稳定。基于这一原理，多种氢键体系被用于构建高强度水凝胶。例如，Das等人在没有共价交联剂的情况下，基于丙烯酰胺的聚合，开发了一种高度可拉伸、坚韧和自愈的超分子水凝胶。同样，Watanabe等人报道了一类新型的超分子胶束离子凝胶，具有多个氢键，在室温下表现出自我修复能力。尽管已经成功地利用这种氢键放大效应构建了许多高强度水凝胶，但由于使用聚合物作为其构建单元，它们仍然缺乏可注射性，这严重限制了它们的临床应用。
本研究在前人对2’-脱氧-2-氨基腺苷(2-DA)和2-氨基腺苷(2-RA)晶体学研究的基础上，通过调节2’-取代基的疏水性，成功筛选了一种单体核苷分子凝胶——2’-氨基-2’-氟-2’-脱氧腺苷(2-FA)，该凝胶可以自组装成具有极高强度和优良剪切减薄注射性的超分子水凝胶。在5.0 wt%的浓度下，其储存模量超过1 MPa，是天然鸟苷(G)水凝胶的约1000倍。此外，它还具有良好的生物相容性、快速的生物降解和良好的抗菌活性。多组学分析显示，抗菌活性归因于“次级信使风暴”效应，该效应降低了细菌的碳氮平衡。基于这些多功能特点，它适用于拔牙伤口的治疗，体内实验结果表明，与商业材料(明胶海绵)相比，2-FA水凝胶降解更快，炎症浸润更少，愈合更彻底。综上所述，2-FA超分子水凝胶的构建不仅为利用多氢键体系制备高强度可注射的超分子水凝胶提供了思路，而且对未来开发具有多种生物医学应用的多功能超分子生物材料具有重要意义。
方案设计：
为了深入研究自组织过程，使用分子动力学模拟方法研究了四种不同化合物在水环境下自组装的过程。
主要结果：
2-FA水凝胶高强度性能的来源
本文试图确定2-FA作为一种超低分子量(MW < 300)凝胶，如何自组装成如此高强度的水凝胶(储存模量> 1 MPa)，这在超分子水凝胶中是罕见的。由于超分子水凝胶通常通过非共价相互作用(如氢键)结合在一起，试图获得单个2-FA晶体来研究其氢键特性；然而，由于2-FA在DH2O中容易形成凝胶，很难得到合适的晶体。因此，通过结构类比来研究这一现象：选择2’-脱氧2’-氟鸟苷(FG)、2- RA和2- DA进行研究，因为2- FA和2- DA(或2- RA)具有相同的碱基片段，即2,6-二氨基嘌呤(DAP)，而2- FA和FG的单晶结构具有相同的糖片段(图1a)。它们的氢键特性提供了关于2-FA水凝胶形成机制的信息。
与2-DA和2-RA类似，2-FA以DAP为碱基，其双NH2基团无疑有助于形成多个氢键微结构域。2-RA和2-DA的晶体结构都含有紧密的Hoogsteen-like碱基对，由6-NH2基团和相邻的N1/N7原子组成的无限链N—H~~N氢键。2-FA和2-DA的变温1 H核磁共振(VT 1 H NMR)谱图表明，当温度从25℃升高到75℃时，2-FA的氨基Δδ值与2-DA的氨基Δδ值接近(2-FA, 6-NH2: Δδ = 0.28 ppm;2-FA, 2-NH2: Δδ = 0.24 ppm;2-DA, 6-NH2: Δδ = 0.28 ppm;2-DA, 2-NH2: Δδ = 0.23 ppm)，表明2-FA和2-DA碱基之间的氢键配对模式相似。
为了进一步证明由NH2基团形成的Hoogsteen样碱基对的重要性，使用氰尿酸(CA)来干扰它们的形成(图1b)。在CA存在的情况下，2-FA水凝胶在7分钟内崩溃。通过分子动力学(MD)模拟研究了2-FA和2-FA+CA组装体系，结果表明CA和2-FA之间的相互作用确实取代了Hoogsteenlike碱基对相互作用。此外，2-FA+CA体系的自组装自由能格局比2-FA体系表现出更大的范围，表明前者的稳定性较差(图1c)。从2-FA+CA系统箱体z轴密度分布分析结果可以看出，加入CA后，在z[−1,0]方向密度没有急剧下降，密度分布更加均匀，没有明显的空腔(图1d)。同一体系的溶剂可及表面积(SASA)计算表明，难溶性CA的SASA大于高溶性2-FA，表明CA的存在通过破坏支撑结构(Hoogsteen-like碱基对)损害了水凝胶捕获水分子的能力，从而导致2-FA水凝胶崩溃。
除了双NH2基团外，水分子对于构建多氢键体系也特别重要，因为水凝胶本质上是基于它们的吸水性形成的。许多研究表明，水是水凝胶许多内在特性的重要因素，如其膨胀行为、生物相容性和机械性能。因此，进一步研究了FG、2-FA、2-DA和2-RA的溶解行为，只有2-FA和2-DA表现出良好的溶解性。之前的研究表明，2-DA的晶体结构表现出独特的三氢特征，这使得它能够以两种不同的构象与水分子连接。相反，2-RA和FG的晶体结构中不存在水分子。2-FA与水分子相互作用的高度倾向使假设它会与2-DA表现出类似的行为。2-FG和2-RA在水溶解期间未观察到放热反应，而2-FA和2-DA在第二溶解阶段观察到明显的放热峰，表明2-FA和水分子之间形成了氢键。采用差示扫描量热法(DSC)和低场核磁共振(LF-NMR)分析确定了2-FA水凝胶和FG、2-DA、2-RA和2-FA+CA水溶液中水的不同状态(图1e,f)。一般将水的状态分为三种：自由水、冻结结合水和非冻结结合水(或粘结水)。虽然前两种类型在规则熔点熔化，但最后一种类型不会，并且已经证明结合水有助于水凝胶的强度。在DSC结果中，0-10°C附近的吸热峰一般归因于冻结结合水和自由水的含量。
在LF-NMR结果中，在1-15、15-500和>500 ms处的峰分别属于键合水、冻结结合水和自由水。如图1e所示，相同含水量的4种样品(2-FA、2-DA、2-RA和FG)在0-10°C左右出现吸热峰。在此范围内，2-FA和FG相对于2-RA和2-DA的焓变较小，说明它们在冷冻结合水和自由水中的含量较低，而在结合水中含量较高。LF-NMR结果表明，2-RA中键合水含量降低，与晶体衍射分析数据一致。与DSC结果不同，LF-NMR结果表明，2-DA和FG含有较高比例的键水；然而，由于它们不能自组装成纤维来封装冻结的结合水，因此仅在2-FA中观察到这种情况。相应地，比较2-FA和2-FA+CA的结果发现，当CA引入2-FA时，冻结结合水被键水取代，再次证实了Hoogsteen-like碱基对的重要性。
为了进一步确定2-FA对水的影响，在B3LYP-D3/def2-TZVP水平上进行了模拟计算，研究了周围水分子的分布情况。考虑到2-FA和2-DA相似的亲水性行为，以及它们相似的碱基对模式(如VT 1h NMR结果所示)，将4个2-FA分子排列成Hoogsteen-like碱基对结构，类似于之前确定的2-DA(图1g)。得到了一个与12个水分子溶剂化的结构，其中每个2-FA基团在N3原子处与一个水分子相互作用，这与2-DA的单晶数据一致。所有其他的水分子都位于糖的周围。这些结果表明，这种碱基对模式起到了支撑支架的作用，并将水分子吸引到水凝胶的上层结构中，这两者都有助于2-FA水凝胶的高强度。
考虑到双NH2基团和水分子对多氢键体系的贡献，可以意识到，虽然2-DA和2-RA基团含有DAP碱基，但它们在dH2O/PBS环境中不会自组装成水凝胶。这表明，2 ‘ -F基团也有助于水凝胶的高强度。通过计算单个2- FA分子的静电电位，并比较它们的构象参数，我们推测由于2 ‘ -F基团的强电负性，糖基键旋转倾向于反构象，糖皱缩倾向于C3 ‘ -内切构象。此外，我们推测2′-F基团也参与了H~~F氢键的构建，而H~~O/ H~~N氢键的强度一般大于H~~O/ H~~N氢键。在FG的晶体结构中，C5 ‘—H5 ‘~~F2 ‘氢键被证实参与糖-糖相互作用。为了阐明溶液中涉及氟原子的氢键的形成，对2-FA和FG基团进行了变温19F NMR (VT 19F NMR)分析。随着温度从25℃升高到75℃，2- FA和FG的2’-F信号呈上移趋势；特别是，2- FA的2′-F峰从- 204.37 ppm(25℃)移动到- 203.89 ppm(75℃)(Δδ = 0.48 ppm)，而FG的2′-F峰从- 203.25 ppm(25℃)移动到- 203.05 ppm(75℃)(Δδ = 0.20 ppm)。这种行为表明2- FA(和FG)中的2′-F基团与邻近分子之间存在分子间相互作用。
除了H~~F的内在性质外，还研究了F氢键在捕获水分子中的作用。此外，DSC和LF-NMR结果均显示FG水溶液和2-FA水凝胶中键合水分子比例较高，表明2’-F的存在进一步促进了水分子的吸引力（图1e，f）。然后，进行额外的仿真计算以研究水的分布和VT1采用H NMR研究了糖-糖的相互作用。结果表明，2-FA中羟基的Δδ值与FG中的Δδ值几乎相等（2-FA: 3′-OH. Δδ = 0.24 ppm; FG: 3′-OH, Δδ = 0.23 ppm; 2-FA：5′-OH, Δδ = 0.23 ppm; FG：5′-OH，Δδ = 0.25 ppm），表明2-FA的3′-OH和5′-OH基团中的氢原子参与了氢键的形成，并且2-FA糖结构域的氢键配对模式可能与FG相似。因此，将四个2-FA分子排列成类似于FG的糖-糖相互作用模式（图1h），最终获得了与12个水分子溶剂化的结构。如图1h所示，三个水分子与每个相邻的糖基团结合并形成紧密的基层，表明被吸引的水分子在增强系统方面也起着至关重要的作用。这种行为也可以解释为什么CA和2-FA的同时存在导致该系统崩溃：CA的参与显着增强了π-π堆积，并导致相邻基层之间的水分子被压缩出来，从而导致水凝胶的崩溃。基于这些结果推测，由2′-F和相邻水分子构建的稳健氢键也参与了多氢键系统的形成，在此过程中吸引了更多的水分子，并增加了水凝胶的强度。此外，被吸引的水分子通过氢键收紧了相邻基层之间的键合强度，进一步增强了整个体系的强度。
图1 晶体结构对比揭示高强度机理
2-FA水凝胶的自组装机理
为了在纳米尺度上深入研究自组装机理，对2.5 wt% 2-FA水凝胶进行了MD模拟，dH2O为溶剂。将60个2-FA分子随机放置在一个小的周期性水箱中（图2a），50 ns后，分子自组装成短纤维结构。100 ns 后，额外的分子聚集起来，最终形成一个大聚集体。沿盒子的z轴的密度分布分析表明，其中心存在一个密度降低的半空心区域（图1d和2a）。此外，随着自组装的进行，系统中分子间氢键和π-π堆积的速率增加，反映了它们在自组装过程中的参与不断升级（图2b，c）。
2-FA水凝胶主要由糖和碱基部分组成。为了进一步确定这些组分在自组装过程中的具体作用，还计算了它们的SASA和它们连接的水分子数量。随着自组装的进行，碱基部分的SASA降低了≈60%，而糖基团的SASA降低了≈40%，这表明与水分子的相互作用导致后者的SASA降低不如前者明显（图2d）。较高的SASA分数和糖基团中连接的水分子数量表明，2-FA自组装系统具有许多暴露的亲水区域，为与水接触和形成统一系统提供了充足的机会（图2e）。由于粉末 X 射线衍射 （PXRD） 表示电子密度不同平面之间的距离，因此将通过 MD 分析获得的距离与 PXRD 数据进行比较，以深入了解系统的电子组成（图 2f）。与溶解前的粉末相比，冻干超分子水凝胶的模式在2θ = 7.8°、15.9°、23.5°和25.8°处分别具有不同的峰，对应的间距分别为11.32、5.57、3.78和3.45 Å。3.78 和 3.45 Å 的间距与 π–π 堆叠的间距相匹配（前向堆叠距离：3.61 Å; 反向堆叠距离：3.34 Å; 图2g），而11.32和5.57 Å的间距分别与DAPs中的单分子宽度（H5’-N6：5.80或5.83 Å）和碱基对宽度（H5’-H5’; 11.68 Å）相匹配（图2h）。此外，π–π的堆叠距离恰好是相邻水连接基层的一半，表明这两个基序共存。因此，MD和PXRD数据的匹配表明纤维结构是自发形成的，具有基序长度尺度，证实了所提纤维结构的合理性。此外，MD和PXRD数据表明，π–π堆积和DAPs之间的碱基对相互作用在2-FA自组装系统中起主导作用。
图2 2-FA水凝胶的自组装过程
根据这些数据制定了2-FA水凝胶的自组装范式，如图2i所示。当将2-FA水凝胶溶解在dH中时2O，碱基对和糖-糖的相互作用促进了两个方向的连接。同时，由于糖基团的吸引力，水分子聚集并与相邻的基层紧密相连。水连接基层之间的距离是π–π堆叠距离的两倍，表明基对形成后，基对层之间只剩下一个2-FA分子，与中间的水分子结合，进一步强化整个系统。最后，构建了具有多氢键系统的动态三维交联网络。这种水增强网络吸引并捕获了更多的水分子，直到形成高强度的超分子水凝胶。
结论：
通过设计多氢键系统，本文成功制备了一种高强度（1 MPa，浓度为5.0 wt%）和可注射（在37°C下溶胶-凝胶在几秒钟内转变）的超分子水凝胶，该水凝胶由2-FA核苷自组装。分子动力学分析在模拟计算的辅助下表明，多氢键体系基本上由双NH组成2基团、2’-F 原子和水分子。在评估其生物相容性后，验证了2-FA对细菌生长的抑制作用，诱导了“次级信使风暴”效应，破坏了碳氮平衡。与市售的抗出血剂（如明胶海绵）相比，其应用便利性、机械耐久性、强度提供、更快的降解率以及巨噬细胞调节和破骨细胞抑制作用，都有助于减少炎症浸润诱导，并在拔牙槽中实现更完整的愈合。本文报道的结果证实，通过设计多氢键体系，超分子水凝胶可以实现高强度和最佳注射性。当用作拔牙牙槽愈合剂时，2-FA水凝胶的优点证明了其作为超分子生物材料用于各种生物医学工程目的的潜力。
