合作单位：Guangdong Pharmaceutical University
参考文献：Y Li, K Hu, C Huang, et al. Improvement of solubility, stability and antioxidant activity of carotenoids using deep eutectic solvent-based microemulsions. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces, 2022, 207, 112591. DOI: 10.1016/j.colsurfb.2022.112591(IF=5.8)
背景：
类胡萝卜素是最重要的抗氧化剂之一，因为它们的化学结构中有八个异戊二烯分子。一般来说，类胡萝卜素分为两种类型：由氢原子和碳原子组成的胡萝卜素（如β-胡萝卜素、番茄红素）和含有一个或多个氧原子的叶黄素（如叶黄素、虾青素和β-隐黄质）。在浓度≥400mg/L时，叶黄素对油氧化的抑制作用与维生素E相当。据报道，虾青素的抗氧化活性是维生素E的100倍。因此，从自然资源中提取虾青素和叶黄素等类胡萝卜素最近受到了人们的关注。Irshad等证明，使用二氯甲烷可以从球磨雨生红球绦中提取31.6 mg/g的虾青素。以醚/乙醇（1：3，v/v）与1.25 KOH g/L的混合物为溶剂，提取小球藻叶黄素，回收率大于8 mg/g。不幸的是，大多数提取天然类胡萝卜素的技术主要依赖于有机溶剂。另一方面，类胡萝卜素在提取或储存过程中在有机溶剂中的稳定性被证明较差。Ceron-Garcia等发现，在室温下储存6周后，通过丙酮损失40%从Scenedesmus almeriensis中提取的叶黄素。因此，尽管取得了相当大的进展，但开发合适的天然类胡萝卜素溶剂以确保提取过程的安全性、效率和稳定性仍然是一个重要的挑战。
近年来，深共晶溶剂（DES）在重金属、氨基酸、类胡萝卜素、着色剂和激素的提取中得到了广泛的应用。DES是氢键受体（HBA）和氢键供体（HBD）的共晶混合物。DESs同时用作色氨酸对映异构体的液-液萃取的相形成组分和手性选择器。 使用DES（DL-薄荷醇：乳酸）的番茄红素收率达到1446.6 μg/g，高于乙酸乙酯（1343.9 μg/g）。与有机溶剂、植物油和IL相比，DESs作为新型溶剂普遍具有独特的优势，包括成本低、潜在的生物降解性和可忽略不计的毒性。然而，据报道，大多数DES的粘度远高于有机溶剂。因此，在萃取过程中，通常使用有机溶剂（如乙醇和丙酮）作为助溶剂来降低纯DES的粘度。
先前的研究表明，在酸性条件下，类胡萝卜素的提取效率和抗氧化能力显着提高。DESs（DL-薄荷醇：有机酸）已被用于提取生物分子、杀虫剂和药物，如色氨酸、麦角甾醇、双氯芬酸、哈明。本研究以有机酸（包括乙酸、丙酸、戊酸和辛酸）为基础的DESs，用吐温80和水制备了一系列ME。为了选择合适的MEs比例，研究了基于DES的MEs在不同温度下的相行为和物理化学性质（粘度、pH值和直径）。随后，选择合适的MEs来溶解虾青素、虾青素酯和叶黄素。评价了类胡萝卜素在MEs中的溶解度分布和最大溶解度。最后，比较了类胡萝卜素在MEs中的储存稳定性和DPPH自由基清除活性与有机溶剂（乙醇、甲醇和丙酮）。该研究旨在为天然类胡萝卜素提供一种新的溶剂和输送系统。
方案设计：
为了研究DES溶剂和虾青素（Astaxanthin, As）、虾青素酯（Astaxanthin ester, Ast）和叶黄素（Lutein）之间的相互作用，探索了复合物之间的亲和力。通过与魔德科技技术团队沟通，拟通过量子化学方法研究了离子液体与低共熔溶剂的结合模式。
主要结果：
为了提高类胡萝卜素在合适的MEs中的溶解度、稳定性和抗氧化活性，有必要研究基于DES的MEs的相行为。系统研究了DESs（DES1、DES2、DES3和DES4）、表面活性剂（吐温20、吐温40、吐温60和吐温80）、类胡萝卜素（虾青素、虾青素酯和叶黄素）和温度（25 °C-55 °C）对相图的影响。结果表明，类胡萝卜素对MEs的胶束化影响不大，而含有吐温80和水的ME1、ME2、ME3和ME4分别能与DES1、DES2、DES3和DES4成功形成。
温度对颜料的溶解度影响很大，溶解度一般随温度升高而增大。然而，大多数类胡萝卜素在高温下可能会诱导部分降解。为了分析基于DES的MEs对类胡萝卜素的溶解和分散能力，在35 °C下评估了溶解度分布，结果如图1所示。ME1中3种类胡萝卜素的红色区域是所有ME中最大的。为了比较四种MEs的溶解能力，表1给出了三种类胡萝卜素的最大溶解度。与ME2、ME3和ME4相比，虾青素（0.27 mg/mL）、虾青素酯（473.63 mg/mL）和叶黄素（12.50 mg/mL）在ME1中的最大溶解度最高。表1所示的三种类胡萝卜素的最大溶解度为ME1>ME2>ME3>ME4，与图1所示的红色区域一致。
图1. 虾青素、虾青素酯和叶黄素在基于DES的MEs中的溶解度分布（Rc= 3.37）在35°C时。红色表示高溶解度，而绿色和蓝色表示低溶解度。
周等发现，在pH=4下使用加压去离子水10 min时，可以从螺旋藻中提取1.406 mg/g叶绿素a ，而pH = 7时提取量仅为0.195 mg/g，pH = 10时提取量仅为0.516 mg/g。另一方面，酸性溶剂的应用增强了细胞壁多糖的降解和色素的释放。本研究以DES1（DL-薄荷醇：乙酸）为基础，pH值最低的ME1对虾青素、虾青素酯和叶黄素的溶解能力最高。此外，4种MEs的溶解能力与不同类胡萝卜素的溶解能力存在显著差异。一般来说，虾青素酯在所有MEs中的溶解度最高，其次是叶黄素和虾青素。
甲醇、乙醇和丙酮是天然类胡萝卜素溶解和萃取的常用溶剂。比较了4种MEs与有机溶剂的溶解能力。如表1所示，与乙醇和甲醇相比，所有基于DES的ME对虾青素、虾青素酯和叶黄素的溶解能力都更强。虾青素、虾青素酯和叶黄素在DES1基ME中的溶解度分别是甲醇的14倍、24倍和17倍。尽管丙酮对类胡萝卜素的溶解能力很强，但虾青素酯和叶黄素在4种基于DES的ME中的最大溶解度都显著大。这些结果表明，基于DES的MEs是有机溶剂的良好替代品，可以改善类胡萝卜素，特别是虾青素酯和叶黄素的溶解。增强的溶解度可归因于来自酸性DES基ME的纳米尺寸和带正电的环境。
本文通过模拟和实验来研究类胡萝卜素在基于DES的MEs中的溶解机制。因此，通过量子化学计算研究了DESs与类胡萝卜素（虾青素、虾青素酯和叶黄素）之间的相互作用。所有DES/类胡萝卜素混合物的优化结构如图S2所示。对于所有系统，O…HBD（有机酸）和类胡萝卜素之间以及HBA（DL-薄荷醇）和类胡萝卜素之间形成了氢键。RDG分析是表征分子中非键合相互作用（包括氢键、范德华相互作用和空间排斥）的有效方法。所有DES/类胡萝卜素系统的分子内相互作用如图S3所示。很明显，所有DES和类胡萝卜素之间都呈现蓝色和绿色区域，揭示了DES/类胡萝卜素系统中氢键和范德华相互作用的共存。
相互作用能 （Eint）计算了4种DESs和3种类胡萝卜素之间的结果，结果见表S1。在所有系统中，E int的值按以下顺序排列：Eint（DES1/类胡萝卜素） < Eint（DES2/类胡萝卜素） < Eint（DES3/类胡萝卜素） < Eint（DES4/类胡萝卜素）。对于不同的类胡萝卜素，E int的值按以下顺序排列：Eint（DES/虾青素酯） > Eint（DES/叶黄素） > Eint（DES/虾青素），这与三种类胡萝卜素在基于DES的ME中的最大溶解度趋势一致（表1）。因此，DES1 与虾青素酯的相互作用最强 （-44.46 kcal/mol），这可以用来解释基于 DES1 的 ME 对虾青素酯的溶解度最高 （473.63 mg/mL）。DES1/虾青素酯混合物的优化结构如图2a所示，DES1s和虾青素酯的梯度等值面如图2b所示。
图2. DES1 和虾青素酯的优化结构 （a）。DES1s和虾青素酯的梯度等值面。碳原子、氢原子和氧原子分别以浅蓝色、白色和红色显示（b）。三种类胡萝卜素在基于DES的ME中的溶解度与DES和类胡萝卜素的相互作用能之间的线性关系（c）。
此外，还研究了MEs中类胡萝卜素的溶解度与DESs与类胡萝卜素相互作用能之间的关系。如图2c所示，每种类胡萝卜素在MEs中的溶解度均表现出良好的线性关系（R2≈ 0.9）与DES/类胡萝卜素的相互作用能。结果还表明，DES与类胡萝卜素HBD之间的范德华和氢键相互作用是促进虾青素、虾青素酯和叶黄素在MEs中溶解的主要内力。类胡萝卜素在ME中的溶解度可以通过计算DES和类胡萝卜素之间的相互作用能来预测。
结论：
天然类胡萝卜素作为着色剂和抗氧化剂广泛应用于食品、医药和化妆品加工中。然而，由于水溶性差，类胡萝卜素在体内的生物活性较低。将DESs (dl -薄荷醇/有机酸)与Tween 80和水在25℃~ 55℃条件下成功形成新型MEs。在Rc= 3.37时，低粘度和pH值的MEs有利于类胡萝卜素的溶解。与有机溶剂（乙醇、甲醇和丙酮）相比，所有基于DES的MEs都显著提高了类胡萝卜素的溶解度、稳定性和抗氧化活性。虾青素（0.27 mg/mL）、虾青素酯（473.63 mg/mL）和叶黄素（12.50 mg/mL）在DES1（DL-薄荷醇：乙酸）组成的MEs中溶解度最高。含有虾青素的基于DES1的ME的DPPH清除效率最高，为92.5%（IC50=1.02 μg/mL）。虾青素的最高稳定性 （t1/2= 13.86）、虾青素酯（t1/2= 69.31）和叶黄素（t1/2= 8.66）在含有DES4（DL-薄荷醇：辛酸）的MEs中获得。此外，与虾青素和叶黄素相比，虾青素酯在MEs中的溶解度和稳定性最高，而虾青素的抗氧化活性最高。此外，基于DES的ME中3种类胡萝卜素的浓度与总色差（△E *）呈线性关系，可以通过颜色参数（L*、a*和b*）计算。该研究为基于DES的MEs提供了潜在的应用，用作类胡萝卜素提取的有机溶剂的替代品。
