合作单位：Chinese Academy of Fishery Sciences
参考文献： Front. Immunol., 2021, 12, 774233.
DOI: 10.3389/fimmu.2021.774233 （IF = 7.3 ）
背景：
鳗弧菌（Vibrio anguillarum）是水生动物的机会性病原体，其运动依靠由聚合的鞭毛蛋白组成的细丝。鞭毛蛋白是鳗弧菌感染的必要毒力因子，鞭毛蛋白包括flaA，flaB，flaC，flaD和flaE，其中flaB在实验过程中表现出最强的免疫刺激效果。但是鞭毛蛋白flaB作用的机制，以及关键氨基酸位点等信息尚不清楚。
方案设计：
为了深入研究鞭毛蛋白flaB作为毒力因子，导致水生动物遭受鳗弧菌感染的作用机制。作者首先研究了flaB对于不同的免疫过程的影响，然后确定TLR5蛋白可以作为后续机制研究的对象。
为了探究flaB与TLR5蛋白结合的关键区域和氨基酸，经与魔德科技技术团队沟通，确定了模拟计算的具体方案，即采用蛋白-蛋白对接方法将flaB对接到TLR5上，根据对接的结果可以判断二者相互作用的氨基酸信息。最后根据分子模拟的结果设计了不同的突变体，并采用表面等离子共振（SPR）技术比较了不同突变体与TLR5的亲和力变化，进而确定二者相互作用的机制。
主要结果：
1、细胞凋亡结果
本文首先进行了细胞凋亡实验，分别检测了TLR5、IL-8和TNF-α的表达。如图1所示，五种鞭毛蛋白均显著性增加了TLR5蛋白的表达，并且呈时间依赖性。孵育120 min后，黄藻诱导的TLR5表达比其他鞭毛蛋白更加显著（p < 0.05）。与TLR5基因表达相似，鞭毛蛋白感染后，IL-8和TNF-α的表达水平也显著增加。
2、分子模拟结果
为了进一步研究Flagellin B在TLR5蛋白表面的结合模式，图2A和B给出了Interface A部分Flagellin B在TLR5蛋白表面的分布及相互作用形式。从图中可以看出，Flagellin B中的N83, E84, N87, Q90, R91, R93, D94, E122, R125, I126和R304，与TLR5中的L208, S238, L241, N242, Y264 S265, H266, I267, N275, N299, N300, Y301和K325形成了较多的氢键，也有疏水相互作用，这些蛋白界面之间的氢键和疏水作用可以增强二者的亲和力。其中Flagellin上的R91, R93, D94与TLR5中N242, S265, N275之间的氢键作用对于Flagellin与TLR5的分子识别具有至关重要的作用[4,5,7,8]。根据蛋白对接的结果可以推测Flagellin B激活TLR5蛋白的作用机制可能是，Flagellin B结合到TLR5蛋白上，影响TLR5的构象变化，使TLR5进行二聚化或与其他蛋白结合（如EGFR），进而引起信号的传导。
3、表面等离子共振研究确定相互作用氨基酸
根据魔德科技计算出来的flaB与TLR5的相互作用模式，作者设计了13个突变体，分别将相互作用的氨基酸残基突变为Ala或Asn（表1），并分别进行SPR实验，结果如表2所示。
从表2中可以看出，相比于野生型蛋白，突变体F1, F2, F4和F12的Kd值明显降低，而其他flaB突变体的Kd值则明显增加。其中F7, F5, F14, F3, F9, F11和F13分别增加了21.8, 14.1, 8.3, 7.9, 4.4, 3.9和2.2倍，结果表明D152, I324, N87, R313, N320和H316在flaB与TLR5的分子识别过程中起到了关键的作用。
总结
本文采用实验方法确定了鞭毛蛋白flaB对于诱导细胞凋亡和炎症反应的能力最强。在体外实验中，通过PAGE，酵母双杂交和荧光分析，证明flaB和TLR5之间存在较强的相互作用。通过分子对接方法研究了二者的相互作用模式，并根据相互作用的氨基酸信息，采用SPR技术对13个氨基酸进行突变，最后验证其中9个氨基酸对于flaB和TLR5的分子识别具有重要的作用。
